ファブゾーベント™(Fabsorbent™)抗体断片精製用
合成リガンド・アフィ二ティ・クロマトグラフィ樹脂

特長

バイオ医薬品及び研究用の道具としての抗体断片需要に対して、プロメティック・バイオサイエンス社は、各種の抗体断片の吸着及び精製用に新しいアフィ二ティ・クロマトグラフィ樹脂を開発しました。ファブゾーベントF1P HF樹脂は、抗体の軽鎖に吸着する合成リガンドを持ち、単価抗体(monovalent antibody)断片(例: Fab、scFv)、設計された抗体バリアント(engineered antibody variants)、単一領域抗体(single domain antibodies)を含む、抗体断片の吸着及び精製用として、従来のプロテインL(Protein L)を超える代替品として使用できます。ファブゾーベントF1P HF樹脂が持つ頑強性と幅広い適応性は、研究開発の初期段階、適応対象の開発段階、そして架橋アガロース担体のピュラビーズが持つ高流速/低カラム圧の特長を生かしての、プロセス用クロマトグラフィでも使用できます。

広範囲でのプロセス製造工程で使用されている、プロメティック・バイオサイエンス社の擬似リガンド(ミメティック・リガンド: Mimetic Ligand)樹脂と、同等の合成リガンドを持つファブゾーベントF1P HF樹脂は、抗体断片を製造する顧客と共同で開発しました。ここではコンビナトリアル・ケミストリー技術を用いて、広範囲において合成リガンドの構造をコンピューターでデザインしたり、合成リガンドのスクリーニングに関するノウハウを応用して、ヒト、ヒツジ、マウス、ウシを含む各種哺乳動物のラムダ型とカッパ型の軽鎖を含む抗体に、吸着するファブゾーベントF1Pリガンドを開発しました。

 

ファブゾーベントF1P HF樹脂による抗体断片の精製

 

F(ab’)2の精製

F(ab’)2抗体断片はインタクトである抗体のFc領域を、ペプシンで切断して二つのFabが結合している断片として生成されます。ファブゾーベントF1P HF樹脂はこのF(ab’)2抗体断片の分取/精製に使用できます。またファブゾーベントF1P HF樹脂はペプシンを吸着しませんので、F(ab’)2抗体断片の精製と同時にフリーのペプシンの除去も行なえます(図2.及び図3.)。

図2. Capture and elution of F(ab’)2 from pepsin digest
Column volume: 10 mL
Flow rate: 250 cm/h
Equilibration buffer: 25 mM Tris-HCl, pH 8.0
Elution buffer: 50 mM sodium citrate, pH 3.0

 

3. Non-reduced SDS-PAGE of F(ab’)2 from pepsin digest
Lane 1: molecular weight markers
Lane 3: IgG standard
Lane 5: pepsin digest
Lane 6: flow through and post load wash
Lane 7: elution fraction

 

大腸菌溶解産物由来の領域抗体の分取/精製

VL領域抗体は抗原に吸着する最小の抗体断片です。組み換えVL領域抗体は一般的に大腸菌などの微生物に作らせ、その細胞溶解産物から精製します。ファブゾーベントF1P HF樹脂このVL領域抗体の分取/精製で実績があります(図4.参照)。ファブゾーベントF1P HF樹脂によるフラクションの非還元SDS-PAGE(図5.参照)は、大腸菌溶解産物由来からVL領域抗体の分取/精製を証明しています。

図4. Capture and elution of a domain antibody from E.coli lysate
Column volume: 1 mL
Residence time: 3 minute
Equilibration buffer: 25 Tris-HCl, pH 8.0
Elution buffer: 50 mM sodium citrate, pH 3.0
CIP: 0.5 M NaOH

 

図5. Non-reduced SDS/PAGE
Lane 1: molecular weight markers
Lane 2: domain antibody containing E.coli lysate
Lane 3: flow through fraction
Lane 4: post load wash
Lane 5: elution fraction
Lane 6: 0.5 M NaOH CIP

 

CHO細胞培養上清からモノクローナルIgG1の分取/精製

抗体断片吸着用に開発されたファブゾーベントF1P HF樹脂は、インタクトIgGの分取/精製用にも使用可能で、CHO細胞培養上精から直接IgG1の分取/精製ができます(図6.参照)。

図6. Chromatogram of the capture/elution of IgG1 from CHO cell culture supernatant
Column volume: 2 mL
Residence time: 3 minute
Equilibration buffer: PBS, pH 7.4
Elution buffer: 50 mM sodium citrate, pH 3.0
CIP: 0.5 M NaOH

 

軽鎖を含む抗体断片吸着用に開発されたファブゾーベントF1P HF樹脂は、CHO細胞培養上精に過剰に発現する軽鎖も吸着し溶出されます(図7.参照)。

図7. Non-reduced SDS-PAGE
Lane 1: Molecular weight markers
Lane 2: CHO cell culture supernatant
Lane 3: flow through fraction
Lane 4: Elution fraction
Lane 5: CIP

 

ファブゾーベントF1P HF 結合性

ファブゾーベントF1P HF樹脂は、プルロニックF68[哺乳動物細胞培養に添加される細胞保護剤(cytoprotective agent)]が含有されてる細胞培養上清及び、微生物が発現した細胞の溶解産物由来から、設計された抗体/抗体断片の分取/精製用に開発されました。ヒト・ ポリクローナル抗体及び、ヒト・ポリクローナル抗体断片に対するマブゾーベントのアフィ二ティ結合解離定数(binding affinity dissociation constant)は10-9Mで、最大吸着量(Qm)は精製済みインタクト抗体で約70mg/mL、抗体断片で約30mg/mLとなります。他の抗体/抗体断片に関する比較結合性は下記の表となります。

表1. 種の違いによるIgGのファブゾーベントF1P HF 結合性

タンパク質の種類 タイプ 動物種 原料体 結合性
Fabポリクローナルヒト精製済み+++
Fabポリクローナルヤギ精製済み+++
Fabポリクローナルウシ精製済み+++
Fab’モノクローナルヒト大腸菌溶解産物+++
F(ab’)2ポリクローナルヒト精製済み++++
F(ab’)2ポリクローナルヤギ精製済み++++
F(ab’)2ポリクローナルウシ精製済み++++
ScFvモノクローナルヒト大腸菌溶解産物+++
IgG1モノクローナルヒトCHO細胞培養上精++
IgG1モノクローナルマウスハイブリドーマ細胞培養上精++
IgG4モノクローナルヒトCHO細胞培養上精++
カッパ型の軽鎖ポリクローナルヒト精製済み++++
ラムダ型の軽鎖ポリクローナルヒト精製済み++++

 

ファブゾーベントF1P HF 仕様

リガンド: F1P合成芳香族トリアジン誘導体
担体: ピュラビーズ P6HF: 6%高架橋単分散アガロース
粒径: 90±10µm
吸着量: <60mg IgG/mL樹脂、<20mgモノクローナル抗体/mL樹脂
(抗体/抗体断片の動物種及びタイプに依存)
流速: <600cm/hour
使用圧: 3bar(45psi)
使用pH: pH1.5〜14
pH安定性: pH3〜13(三ヶ月長期)
耐薬品性: 総ての一般的な水溶性バッファー
殺菌性: 0.5〜1.0M NaOH、25ºC
保存: 20%エタノール

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