プライムセップ™(Primesep™)カラム メソッド・デベロップメント ガイド

ここで紹介するプライムセップ(Primesep)製品群は、電荷を持ったアルキル基を導入して、逆相クロマトグラフィにイオン交換体クロマトグラフィを加えた、ミックス・クロマトグラフィモードのカラムです。

カラム固定相の電荷は、移動相のpHに影響されます。そして多くの化合物も、溶媒のpHによって、その電荷状態が変化します。もし対象化合物が(+)か(−)の電荷を持っていて、プライムセップHPLCカラムを使用して、逆相クロマトグラフィ以外にイオン交換体クロマトグラフィを試みる場合は、対象化合物とカラム固定相の電荷は正反対になっていなくてはいけません。このガイドはプライムセップ製品群の中から、どのカラムを選択すればよいかの参考となります。

プライムセップHPLCカラムを選択する際に、必要な三つのステップ

ステップ1: 対象化合物のpKa値と構造から、最適な棒グラフを選び、次に対象化合物が電荷を持つpH範囲を選択する

注意事項:幾つかの化合物は使用pH範囲において、一つ以上の電荷を持つ箇所が生じます(例:アスパラギン酸、グルタミン酸など)。またどのようなHPLCの分析条件下でも電荷を持たない化合物は、総てのプライムセップHPLCカラムが有する逆相クロマトグラフィで分析できます。逆相クロマトグラフィや疎水クロマトグラフィ以外にも、順相クロマトグラフィ、親水クロマトグラフィ(HILIC: Hydrophilic Interaction Chromatography)、π-πインターラクション(プライムセップPカラム)なども利用できます。

ステップ2: ステップ1で選択した検出器及びスケールアップの際に、必要となる条件を満たすpH範囲で、対象化合物が電荷を持つ最適なバッファー

注意事項:対象化合物とカラム固定相の電荷が正反対で吸着している場合、対象化合物がカラムから溶出するには、移動相に他のイオンが存在しなければなりません。水とアセトニトリルだけでは、移動相中にイオン交換体クロマトグラフィモードを行なうのに、十分なイオンを作りだす事はできません。その結果、プライムセップHPLCカラムに吸着した電荷を持つ化合物の保持時間が、非常に長くなりピークもブロードになってしまいます。一般的なHPLCで使用されるバッファーは、イオン交換体クロマトグラフィモードを行なうのに、十分なイオンを供給します。

使用する検出器によって、二つの異なったバッファーがあります。:

TFA系バッファーだけが、上記にある両方の用途で使用できますが、TFAはMSには不向きですし、低いUV波長での使用もできません。

陽イオン交換体/逆相 ミックス・クロマトグラフィHPLCカラムは、バッファー無しの移動相でも使用することができます。カラムに導入されている酸性基が、バッファーの酸性成分として作用します。酢酸アンモニウムやぎ酸アンモニウムなどの塩が、MS、ELSD、分取クロマトグラフィ用に使用されます。また硫酸カリウムはUV検出器に使用されます。

ステップ3: 対象化合物の電荷と正反対の電荷をカラム固定相に持つ、最適なプライムセップHPLCカラムの選択

注意事項:転換pHにおけるプライムセップHPLCカラムは、徐々にカラム固定相の電荷が無くなるか変化します。この過程は可逆的で、他の移動相におけるpHにおいて、再度電荷特性を復元します。バッファーを含有しない移動相を使用したカラムは、この表においては、pH 7でのカラム固定相の電荷に符号します。転換pHで一定の結果を得るためには、イオン的修正移動相が十分な緩衝作用を持たなくてはなりません。

他のプライムセップHPLCカラムと違って、プライムセップABカラムは双性イオン交換体/逆相カラムで、対象化合物によって固定相の電荷が選択されます。

プライムセップBカラム以外の総てのプライムセップHPLCカラムは、pH 1.5〜7の範囲で使用できます。そしてプライムセップBカラムは、pH 1.5〜4.5の範囲で使用できます。

これらの表を参考にして、対象化合物を逆相クロマトグラフィ及びイオン交換体クロマトグラフィモードで吸着できるカラムを選択して下さい。