クロマチンを構成するタンパク質群であるヒストンはH1、H2A、H2B、H3、H4の主だった五種類があります。そのうちH2A、H2B、H3、H4の四種類はコア・ヒストンと呼ばれ、これらのコア・ヒストンが二分子づつで構成するヒストン八量体を146bpのDNAで1.75回巻きしたヌクレオソームが、クロマチンの基本的単位です。そしてヌクレオソーム間のDNAに結合するリンカー・ヒストンであるH1にはH1.2、H1.3、H1.4、H1.5といったサブタイプが存在し、そのうちH1.5 のリン酸化部位に関して、今回はオーストリアDr.Herbert Lindnerのグループが詳細に検討しています(出典文献1.)。ここではリン酸化されたヒストンの分離において、その修飾リン酸基数の違いを、弱陽イオン交換体カラムポリキャットA（PolyCAT A）の陽イオン交換体／親水クロマトグラフィ(HILIC)ミックス・モードによって、非常に良く分離する事ができました。

転写開始を誘導する一つのファクターであるヒストン修飾の種類は多岐にわたり、アセチル化、メチル化、リン酸化、ユビキチン化などあげられます。そしてこれらの修飾は一つの修飾が他の修飾を誘導促進し、連続的に起こって細胞分裂を誘導、あるいは抑制しています。今回紹介する論文では間期、M期にある、ヒトリンパ芽球性T細胞(CCRF-CEM)から単離したH1ヒストンを、逆相クロマトグラフィ(RP)と親水クロマトグラフィ(HILIC)で分画採取し、酵素消化、さらにはアミノ酸シークエンシング、質量分析装置で解析しています。 間期においては、4つのH1サブタイプがこれらの細胞内に存在し、それぞれリン酸化されるサイト数が異なってきます。　ヒストンH1.5は3ヶ所、H1.4は2ヶ所、H1.3とH1.2は1ヶ所のみリン酸化されます。このリン酸化は特定部位で行なわれ、SP(K/A)Kモチーフのセリン(Ser)残基がリン酸化を受けます。M期にある細胞から得られたH1.5のリン酸化部位は、間期に比べてさらにリン酸化を受けており、それはC末端のTPKKモチーフ上のトレオニン(Thr)残基がリン酸化ターゲットになっています。H1.5はC末端にTPKKモチーフを2ヶ所(Thr137とThr154)持っていますが、そのうちのどちらかがリン酸化を受けてテトラ・リン酸化タンパク質となります。さらにH1.5は、N末端にあるノンコンセンサスなモチーフのThr10がリン酸化を受け、ペンタ・リン酸化タンパク質になります。この論文で示すデータはヒトH1のバリアントのリン酸化が、非ランダム的に間期とM期の両時期に起こり、別個のセリン特異的あるいはトレオニン特異的なキナーゼが、異なるセルサイクル・フェーズに存在することを示唆しています。

筆者らは特にH1.5の10位のトレオニン残基のリン酸化に着目し、一つの仮説（可能性）を立てています。それは様々な癌細胞で過剰発現して、H3の10位のセリン残基をリン酸化するAurora　B　kinaseは、悪性腫瘍にしばしば見られるクロモソームの不安定化に関与しているといわれていますが、そうするとこのM期におけるH1.5のN末端側のリン酸化も腫瘍形成に関わっているのかもしれない・・・という仮説です。　これに関しては今後の研究（キナーゼの探索やリン酸化される意味）が期待されます。

図1. 細胞分裂間期におけるリン酸化H1.5ヒストンの分離（HILICクロマトグラフィ・モードの分離能をCEと比較）

A. CCRF-CEM細胞から過塩素酸抽出した32P-ヒストン(500µg)をNucleosil 300-5 C4カラム(250×8mm)で分離 B. A.で分取したH1.5をキャピラリー電気泳動（CE）で分離 C. A.と同条件で分離したH1.5(〜150µg)をHILICで分離 カラム： PolyCAT A 1000Å, 5µm, 200×4.6mm(204CT0510) 流速： 1.0 ml/min 温度： 23℃ 移動相A： 70％ｱｾﾄﾆﾄﾘﾙ／15mM TEA/H3PO4, pH3.0 移動相B： 移動相A +　0.68M NaClO4 分離条件 (二段階ｸﾞﾗｼﾞｴﾝﾄ)： 0→60%B／5min 60→100%B／35min 100→100%B／20min ﾘﾝ酸基の数や位置はｷﾓﾄﾘﾌﾟｼﾝ処理、ESI-MSにより同定。p0,p1,p2,p3はﾘﾝ酸基の数、p1g、p1mはﾓﾉﾘﾝ酸化ﾌﾗｸﾞﾒﾝﾄで、相対量の多いものをg、ﾏｲﾅｰﾌﾗｸｼｮﾝをmと表記。

図2. HILICクロマトグラフィ・モードによるColcemid処理した細胞から過剰リン酸化H1.5ヒストンの分離

A. RP-HPLCで分取したH1.5(〜150µg)をHILICで分離 カラム： PolyCAT A 1000Å, 5µm, 200×4.6mm(204CT0510) 流速： 1.0 ml/min 温度： 23℃ 移動相A： 70％ｱｾﾄﾆﾄﾘﾙ／10mMTEA／MPA,pH3.0 移動相B： 移動相A+　1M NaClO4 分離条件 (二段階ｸﾞﾗｼﾞｴﾝﾄ)： 0→30%B／5min 30→100%B／60min 100→100%B／20min p0からp5はﾘﾝ酸基の数、p1g、p1mはﾓﾉﾘﾝ酸化ﾌﾗｸﾞﾒﾝﾄで、相対量の多いものをg、ﾏｲﾅｰﾌﾗｸｼｮﾝをmと表記。　p4,p5の結合力が高いため、TEAをMPA変更、NaClO4の濃度をあげて溶出しているが、逆にp1g/の分離が悪くなっている。 B. 間期とM期におけるH1.5 のリン酸化部位のまとめ リン酸化部位については種々の消化酵素（ｷﾓﾄﾘﾌﾟｼﾝ、ﾄﾘﾌﾟｼﾝ、Glu-Cなど）で処理した後、LC-MS/MSで同定している。

出典文献1. Histone H1 Phosphorylation Occurs Site-specifically during Interphase and Mitosis
IDENTIFICATION OF A NOVEL PHOSPHORYLATION SITE ON HISTONE H1, Bettina Sarg, Wilfried Helliger, Heribert Talasz, Barbara Forg, and Herbert H. Lindner, The Journal of Biological Chemistry Vol. 281, No.10,
pp. 6573?6580, March 10, 2006