オンライン・疎水クロマトグラフィ(HIC: Hydrophobic Interaction Chromatography)カラム／質量分析装置によるインタク・モノクローナル抗体の解析法

医療用モノクローナル抗体(mAbs)及びその誘導体は、癌、自己免疫疾患、代謝疾患、感染症など、広範囲な人類の病気治療に重要な薬です。モノクローナル抗体が持つ独創的な薬理学上の長所(例：標的特異性、選択性、長い半減期、優れた安全性)と、進化するタンパク質工学 [例：二重特異性抗体、フュージョンタンパク質、抗体－薬物複合体(ADC)、ナノ抗体] は、継続して新しい抗体医薬品の開発を推進するために、何百もの候補対象物が臨床中です。しかしその複雑な立体構造、構造動力学、高分子量のサイズ、各種の翻訳後修飾による微小不均一性から、モノクローナル抗体及びその誘導体は、過去に製造されたことがないほどに非常に複雑な生物製剤で、包括的なキャラクタリゼーションのために、また製剤品質を保証するために、非常に大きな分析的チャレンジが要求されます。

液体クロマトグラフィ(LC)と質量分析装置(MS)は、医療用モノクローナル抗体のキャラクタリゼーションにおいて強力な解析ツールです。LCの分離モードとしては、逆相クロマトグラフィ(RPC)、サイズ排除クロマトグラフィ(SEC)、疎水クロマトグラフィ(HIC)、アフィニティ・クロマトグラフィなどがあり、製剤中の異成分と不純物の含有を評価するのに使用します。トップダウン、ミドルダウン、ボトムアップ、ネイティブMSは、一次配列を決定するのに用いられる手法です。そしてオンラインLC-MSとして用いることで、ワークフローを簡略化し、オフラインでの作業を削除できます。

ここで紹介する筆者らの一部は、2016年頃より初めてのオンラインHIC-MSによるトップダウン・プロテオミクスを紹介してきました。重要なことはHICがタンパク質を変性することなく、天然の構造のままモノクローナル抗体を分離、解析できる唯一の手法であるという点です。従ってオンラインHIC-MSは、タンデムMS(MS／MS)手法を採用して、モノクローナル抗体の相対的な疎水性、不均一性の査定、アミノ酸配列や構造情報の取得が可能となります。ここで特筆すべきことは、初めてインタクト・モノクローナル抗体を四重極飛行時間型(Q-TOF)質量分析装置と、フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴(FTICR)質量分析装置を利用して解析し、モノクローナル抗体の疎水性や糖鎖のバリエーションを明らかにしました。また二量体、三量体といった非共有結合の多量体が、解離せずに保持されて検出できます。更にオンラインHIC-MSと電子捕獲解離反応装置(ECD)を利用して、モノクローナル抗体のアミノ酸配列、構造的キャラクタリゼーションに関して、特にジスルフィド結合以外の相補性決定領域(CDR: Complementarity-Determining Region)を証明しました(出典文献1.)。

疎水クロマトグラフィ分析条件

図1. モノクローナル抗体混合物(mAb1、mAb2)のオンラインHIC-MSによる解析

1. トータル・イオン・クロマトグラムで、各ピークはmAb1とmAb2の分離を表示し、点線は移動相Bのグラジエントを指示します。
2. mAb2のモノマー、二量体、三量体のマススペクトラムで、二量体、三量体はそれぞれ30倍、100倍表示です。
3. mAb2モノマーのデコンボリューション・スペクトルで、各ピークはFcに結合した糖鎖を含有する分子量を表示しています(赤い三角: フコース、青い四角: GlcNAc、緑の丸: マンノース、黄色い丸: ガラクトース)。ピークショルダーにある四角い枠はGlcNAcの欠損(－204 Da)、三角の枠は重鎖C末端のリシン(Lys)保護(＋128 Da)、星印はヘキソース付加(＋162 Da)を示します。GxFのxは糖鎖の末端に結合している、ガラクトースの個数を表します。

図2. ECD で糖鎖を除去したmAb2を12T solariX XR FTICR質量分析装置によるオンラインHIC-MS／MSで解析

1. 糖鎖結合mAb2のECDスペクトル(12T solariX XR FTICR使用)
2. CDRs H3とL3 [重鎖(上部)、軽鎖(下部)]からの断片イオン
3. mAb2のFab断片の結晶構造、ECD(赤で表記されているH3とL3)によるCDRsの断片とそれ以外のCDRs(青で表記されているH1、H2、L1、L2)

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